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华越洋生物(北京)科技有限公司

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western blot 一条龙全套试剂用品
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招商区域: 北京
有效期至: 长期有效
最后更新: 2011-02-15 09:17
详细信息
    蛋白印迹,也称Western,Western blot、Western blotting、Western印迹,是用抗体检测蛋白的重要方法之一。蛋白印迹可以参考如下步骤进行操作。
       1.蛋白样品的制备(Protein sample preparation)
可以选用适当的裂解液(华越洋生物:高效RIPA组织/细胞裂解液),裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白,例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等,可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白,也可以使用试剂盒进行蛋白抽提(华越洋生物:组织/细胞总蛋白提取试剂盒(大,中,微量提取)。
   为确保每个蛋白样品的上样量一致,收集的蛋白样品均应测定其蛋白浓度。蛋白浓度的测定方法,应根据组织细胞裂解或匀浆所使用的方法及裂解液的不同选用,因为去垢剂和还原剂等对不同蛋白浓度测定方法的影响差别很大。华越洋生物:超灵敏蛋白定量试剂盒准确检测蛋白浓度(Bradford法蛋白定量试剂盒,BCA法蛋白定量试剂盒,超敏型BCA法蛋白定量试剂盒,改良Lowry法蛋白定量试剂盒福林酚试剂、蛋白质定量标准品)

       2. 电泳
       (1)SDS-PAGE凝胶配制
       SDS-PAGE凝胶可以参考文献资料进行配制,(华越洋生物:SDS-PAGE一站式电泳全套装)该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
       (2)样品处理
在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液,于100℃或沸水浴中加热3-5分钟,以充分变性蛋白。使用浓缩的蛋白上样缓冲液可以减小上样体积,在相同体积的上样孔内可以加入更多的蛋白样品。蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料自行配制(华越洋生物:SDS-PAGE一站式电泳全套装中已配好)。Tricine-sds-page电泳套装,蛋白非变性PAGE电泳套装。
       (3) 上样与电泳
       冷却到室温后,把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。为了便于观察电泳效果和转膜效果,以及判断蛋白分子量大小,最好使用预染蛋白质分子量标准(华越洋生物提供这种范围长度的蛋白marker )。电泳时通常在上层胶时使用低电压恒压电泳,而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于标准电泳装置或类似电泳装置,低电压可以设置在80-100V,高电压可设置在120V左右。标准电泳装置或类似电泳装置,低电压可以设置在80-100V,高电压可设置在120V左右。
       采用普通的电泳仪就可以满足SDS-PAGE电泳的要求。为方便起见,也可整个SDS-PAGE电泳过程均采用恒压的方式,通常把电压设置在100V,然后设定时间为90-120分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过冲。
       通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳,或根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况,预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。华越洋蛋白质胶回收试剂盒,PAGE胶染料
       3. 转膜(Transfer)华越洋生物WB转膜液
       在Western实验中,我们推荐选用华越洋生物的硝酸纤维素膜(NC膜)13*20cm,硝酸纤维素膜比较脆,在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。
       转膜时,具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定,目的蛋白的分子量越大,需要的转膜时间越长,目的蛋白的分子量越小,需要的转膜时间越短。如使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置,转膜电流可设定为80V/2H or 10V过夜。
       在转膜过程中,特别是高电流快速转膜时,通常会有非常严重的发热现象,最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。转膜效果可以通过预染蛋白质分子量标准观察转膜效果,通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色,以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝染色液对转膜后的PAGE胶进行染色,以观察蛋白的残留情况。
        4. 封闭(Blocking) 转膜完毕后,立即把蛋白膜放置到预先准备好的华越洋生物WB洗膜液中,漂洗1-2分钟,以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕起,以后所有的步骤均要注意膜的保湿,避免膜的干燥,否则极易产生较高的背景。可用巴斯特吸管吸尽洗涤液,加入WB封闭液,在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。如背景较高,可以在4℃ 封闭过夜。在整个Western过程中可使用侧摆摇床,侧向摆动速度比较缓慢,而且也容易让溶液覆盖蛋白膜。
        5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)
        参考华越洋生物一抗的说明书,按比例用WB一抗稀释液适当稀释一抗。用巴斯特吸管吸尽封闭液,不要漂洗,直接加入稀释好的一抗,室温侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时在再37℃水箱一小时。如果效果不佳,可以在4℃缓慢摇动孵育过夜。回收一抗,加入WB洗涤液,在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。洗净洗涤液后,再加入WB洗涤液,,漂洗3-6次,每次5-10分钟。如果结果背景较高可以适当延长漂洗时间并增加漂洗次数。
        6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)
        参考华越洋生物二抗的说明书,按照适当比例用WB二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。用巴斯特吸管吸尽洗涤液,立即加入稀释好的二抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。回收二抗,加入WB洗涤液,在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。洗净洗涤液后,再加入洗涤液,漂洗3-5次,每次5-10分钟。如果显色结果背景较高,可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
        7. 蛋白检测(Detection of proteins)
       检测结果可使用华越洋生物显色试剂(增强型DAB,沉淀型TMB显色试剂盒)来检测蛋白,具体使用细节请参考相关产品说明书.
       8. 膜的重复利用(Membrane recovery)
       如果蛋白样品非常宝贵,可以使用华越洋生物WB抗体去除液处理蛋白膜,以重复利用蛋白膜。

Western-Blot杂交科研服务     北京华越洋生物 www.huayueyang.com

(一)合同内容

1、收费标准

起始材料

服务内容

规格

价格(元)

细胞或组织或提取好的蛋白

相对定量

内参基因

..

目的基因(每张膜1~8个样品)

..

2、客户需要提供

1)目标基因一抗(特殊内参或公司没有的物种的内参客户也需提供一抗);

2)保存完好的组织材料或模板;

3)其他我方认为实验必须的相关资料或材料。

3、公司承担责任

我方负责对客户提供的样品进行蛋白的提取、电泳,并提交给客户电子版检测报告,包括详细操作程序和实验结果等。我方对实验结果以及客户所提供的资料保密,未经客户许可,我方不得将客户的实验内容、实验结果和相关信息对外公布。

4、备注

1)用户委托本公司进行实验服务时,需预付实验总费用的50%作为定金,余款在实验结束后,本公司向用户交付实验结果后一次性付清;

2)实验所需试剂及耗材由本公司免费提供,用户无须另行购买;

3)由用户所提供的样品或材料所致的实验问题由用户负责;

4)提交报告时间日期以乙方收到预付款及合格样品后30个工作日内,以电子版交给甲方。重复实验不另外收取费用;

5)如样品质量不合格或需重复实验,甲方应继续提供。

Western Blotting的常见问题及解决方法(仅供参考)北京华越洋生物

问 题

出现的原因

解决方法

1. 胶片上存在反转印象 (如:亮的条带.黑的背景)

HRP的浓度过高 

稀释HRP至少10倍

2. 膜上有黄色或棕色的沉积

HRP的浓度过高

稀释HRP至少10倍

3. 在暗室中条带过于明亮

HRP的浓度过高

稀释HRP至少10倍

4. 条带的发光时间持续了至 少8小时

HRP的浓度过高

稀释HRP至少10倍

5. 信号太弱或没有

1.太多的HRP积聚导致信号快速的消退
2.抗原或抗体的浓度不够
3.转印不成功
4.HRP或其他底物的效价降低

1.稀释HRP至少10倍
2.增加其浓度
3.寻找合适的转移方法和条件
4.选择其他的合适底物

6. 背景高

1.HRP浓度过高
2.封闭无效
3.不适合的封闭试剂
4.洗涤不充分和洗涤液的量
5.胶片曝光过度
6.抗原或抗体的浓度太高

1.稀释HRP至少10倍
2.寻找合适的封闭方法
3.选用其他的封闭试剂
4.增加洗涤的时间,次数5.减少曝光时间
6.稀释抗原或抗体

7. 蛋白质条带上 有空泡影像

1.蛋白质没有被充分转印
2.膜没有预先浸湿
3.在胶片和膜之间有气泡

1.寻找合适的转移方法和条件
2.在转印前充分浸湿
3.在暴光之前赶走气泡

8. 胶片上背景弥散

HRP标记的抗体出现了积聚

用0.2μL的滤膜过滤HRP标记的抗体

9. 无特异性条带

1.HRP浓度过高
2.SDS促使非特异蛋白质条带黏附在目的蛋白质条带上

1.稀释HRP至少10倍
2.在操作过程中不要加SDS

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